孙强：在岛上与上千只猴子的9年，我们是如何走过来的丨全景展示世界首个体细胞克隆猴背后的故事
影响重大创新的障碍有哪些？如何在前沿领域实现领跑？重大科技创新需要什么样的价值观、组织模式和体制机制？
2017年11月27日，世界上首个体细胞克隆猴“中中”在中国科学院神经科学研究所、脑科学与智能技术卓越创新中心的非人灵长类平台诞生；12月5日第二个克隆猴“华华”诞生。该成果标志中国率先开启了以体细胞克隆猴作为实验动物模型的新时代，实现了我国在非人灵长类研究领域由国际“并跑”到“领跑”的转变。
近期举行的“纪念建党97周年主题活动暨中科院神经所克隆猴团队先进事迹报告会”上，中科院神经科学研究所所长蒲慕明院士和克隆猴团队主要成员分别做了报告（蒲慕明院士报告链接），全景展示了“中中”、“华华”的诞生过程和期间的苦辣酸甜，并授权三思派刊发。团队负责人孙强研究员的题目是“非人灵长类研究平台这九年”，介绍了他带领团队在苏州的西山岛上，陪伴上千只猴子度过的艰难9年。以下是孙强研究员报告整理。
”各位老师、各位同事，大家下午好，下面我来介绍一下，从2009年有幸来到神经所，来到科学院，这九年的经历。我觉得15分钟可能讲不完，我尽量讲一些有代表性的。
大家一定会感兴趣，为什么我要选择做猴子？实际上这是当时一个可能有一点冲动，或者有一点不太成熟的决定。2004年，我博士要毕业时，华东师范大学有个973项目，就是以做非人灵长类转基因为主。在这之前我一直从事实验动物管理和转基因大小鼠的工作，硕士读书期间曾在科学院训练过，也参与了克隆大熊猫的工作，但我从来没想过克隆猴子。2001年，第一个转基因猴出现了，虽然它比转基因小鼠晚了20年，但当时我就考虑，说不定从事转基因猴的相关工作对我们这些实验动物的从业人员来讲是一个机会。于是我就选择去云南西双版纳山上，与当地的一个灵长类（养殖）公司合作，主要考虑那里有足够多的猴子。这座山位于澜沧江的边上，背靠原始森林，上山要坐缆车，我在山上待了近四年，期间掌握了非人灵长类辅助生殖技术，报道了国内首批试管猴。我在山上一周下来一次去买菜和生活用品，平时就在山上，且我可以深入到这个养殖场的每个角落。这期间我就考虑：“如果将来我去管一个灵长类的设施，我该怎么去弄？这里面有什么问题，有什么东西值得我学习的？还有哪些需要改进的？”我觉得这为我后来组建非人灵长类设施积累了宝贵的经验。非常遗憾，我的梦想是做出转基因动物（猴），因为当时虽然猴的转基因技术建立了，但是真正的转基因猴模型还没有报道，但我却没能如愿，没有得到转基因猴。
国家973项目支持结束以后，我就做不下去了，于是撤了回来，从山上把仪器设施运回来。当时的设想没有成功，如果不能继续做下去，我还要考虑重新出国。因为按照常理，博士毕业后要到国外做个博士后。这个时候蒲先生给我了机会。2009年1月，神经所主持召开一个小型的学术会议，把我这样一个不是很知名的人也请过去作报告。我的报告是倒数第二个，蒲先生的报告是最后一个，但后来取消了，于是给我留了很多时间。当时神经所的好多人都在，问了我很多问题。报告结束以后我感觉像经历了一次面试，我于是就等。如果能来神经所当然非常好，继续做猴子的话我更开心。终于，到2009年的3月23日，顾一希给我打电话说，蒲先生约我聊聊，问我是否有时间。我当时很激动，回复说有时间。3月24日，我跟蒲先生在一起吃个饭，然后就决定来神经所了。
当时蒲老师决定以平台的形式开始非人灵长类的研究工作，要我来负责这个平台。我谈几个条件，其中之一就是我要带两个人过来，王燕和他的先生。他们学历很低，但在云南的猴场做了很长时间，我在云南期间她们也一直帮我做猴子。其二是我希望快速启动，我已经等了半年，不想重头建。我建议在距离上海约两个小时车程的西山岛上，通过租用这里的一个猴养殖场来实现快速启动。为什么选择这里呢？因为这里有很好的设施，有类似猴别墅一样的阳光猴房，还有其他建筑可以做实验室。为什么选择做阳光猴房呢？我们必须要保护动物的健康，动物若是不健康什么都做不来。当时我们租了100多平米的实验室，2009年8月份进驻，当时买了88只食蟹猴，80只母猴，8只公猴。
设施搭建了，还要招人，毕竟它不是在科学院。当时这里它就是一个荒岛，因为我们去基地的小路都没有路灯，不过现在好多了。后来我们租了一个院子，有7、8间房子，我们当时5、6个人。交通工具（当时也没条件买汽车）就是电瓶车，骑十几分钟就可以到。实验室也很小，为了节约启动资金，我们只租了100多平。2010年刘真（后来加入的科研骨干）去的时候也只能躲到这个角落里。为尽快把大家培养起来，我还养了老鼠，在办公室里养。可以说这是简单的开始，但不管怎么说终于开始了，因为我已经等了很久。
要做转基因猴，首先要保证动物的健康。我们在西双版纳弄了两批猴子，第一批猴子几乎没有怎么用。由于长期单笼饲养，产生了很多生殖道感染，不好用了，所以动物是根本。大家想，我们平台到现在接近20个人，现在大概养1千只猴子，在最少人的时候，也就是2013、2014年的时候平台只剩7个人，还要养7、8百只猴子，一年做几千次手术。我们既要负责猴子饲养，还要做试验，这么少的人是我们怎么做到的？为保证健康。猴子在别墅里是自由组群的。我们需要知道猴子的确切月经时间，猴子的月经周期和人是一样的，每28天有一次出血。如果养在单笼里查月经会很方便，饲料员利用笼子的拉杆，一拉就可以把猴子拉到身前进行月经检查了，但是这样猴子会不健康。养在大笼里就有一个月经检查的问题，一笼的猴子有十几只（12-15只），就算总共80几只，两个饲料员每天为了看月经，这也是忙不过来的。我在西双版纳就思考过这个问题，因此在我要求我们的兽医训练猴子，跟猴子做朋友，实现让猴子配合他们检查月经的目的。
我们的每个人要一专多能，不是简单地只是喂猴子的，或者简单地只是兽医。王燕的一个徒弟，2011年来实习，这个视频展示了她检测月经的过程，基本上猴子都挺配合。她还是个小女孩，一笼十几个猴子，她两三分钟就搞定了。我们现在有1千只猴子，不但要管这些，还要做B超。猴子超排的时候每天都要打针，一只猴子一次从超排开始到取卵要打十几天针，早上一针、晚上一针，这个工作也是在大笼子里进行。猴子跟你做朋友以后，你去做这件事它会很配合，效率非常高，你不需要追着它，就能非常顺利地把这件事情做了。我现在招兽医都是要求，你要熟悉猴子，认识这些猴子，因为每个人要管2、3百只。你要认识它们，要让它们和你做朋友，你给它们指令，它们配合你做基本的事情。毕竟我们要做一些事情，我们新成立的实验室顶着很多的压力，就是这样实现了用最少的资源做更多的事。更关键的一点，这些工作让大家觉得在我们这里有奔头，能学到本事，不是简单的做兽医，喂好、养好猴子就行了。上述这些动物管理方面的工作力争是基础，在此基础之上我们还要做事。
2010年国庆节的时候，猴子基本准备好了，实验室人手也够了，我们就开始着手做转基因猴了。第一个是与我们所仇子龙团队合作的自闭症转基因猴。很幸运，我们第一批做的猴子，2011年3月份出生的12只猴子，有8只存活。这8只猴子全部转基因阳性，证明我在西双版纳的技术是可以的，也说明我当时可以做这件事。所以我说这是迟来的转基因猴，因为我认为当时我可以做出来，在版纳工作时也生了十几只猴子。但是这个自闭症猴做出来以后，又有了新的问题，我们的文章投得不顺利，尽管表型分析也很好。为什么不顺利？2008年，Nature发了一篇文章报道一个亨廷顿舞蹈症转基因猴模型的工作。其通讯作者是2001年在Science上报道首个转基因猴的工作的Anthony Chang。当时我博士毕业放弃出国，选择到云南省西双版纳的山上做猴子的原因就是希望能最先做出转基因猴模型来，如果我们2007年底生出的猴子有表型，那么我们就最先做出了有表型的猴子，但是我们没做出。而在2010年我们把猴子做出来了，2012年分析了一堆表型，但这些工作到2013年已经没有创新性了，因为你只是换了个基因，去重复别人的工作，所以我们的文章投稿很不顺利。
但是这件事还是有些好处的。猴子出来以后，蒲先生非常开心。他在2011年夏天的时候去苏州。当时我们住到镇上，刮风下雨的时候过来不太方便。2011年，我们把整栋楼租下来，在这栋楼的旁边有一栋很漂亮的宿舍，共有16栋公寓。我们要求给我们一半，这样我们就住得舒服一点。我们就是住的一个阁楼，一个院墙，把房子简单装修，厨房、卫生间都有了。实际上租下来以后压力也倍增，过去是在一个小地方小打小闹，这个时候我们猴子有几百只，再加上文章也出不来。
2012-2015年是我们成长的五年，也是最有压力的五年。为什么？很关键的问题是我们无产出，我相信蒲先生压力很大，我能感觉到，而且这种压力直接转嫁到我身上。但是我还是有信心，虽然没有产出，但是我们有积累。我们从最初的几个人，然后积累了兽医团队，兽医团队的积累很关键，我们把兽医面临的各种问题，尤其是后来的剖腹产、子猴护理都做了。我们也在开发新的技术，当投稿投不出来的时候，我们想最关键的是如何让它们早生出小猴子。我们很快建立了精超移植技术，不仅把猴子的性成熟时间从五年缩短到两年半，而且用这个办法得到了自闭症转基因猴的F1代。2013、2014年出现了分子剪刀技术，我们也建立了这个技术。更关键的是在2012年我们就启动了体细胞克隆项目。蒲先生非常有战略眼光，我在当时是不敢动的，但蒲先生当时说必须要动这个。我们开始启动了体细胞核移植技术，所以在这期间我们把猴子核移植技术也掌握了，猴子核移植技术也不是那么容易练的。
首先说精巢移植，因为正常猴子性成熟大概是4年，再加半年的怀孕期，总共大概需要60个月，也就是五年时间才能生一个F1代。在座好多读博士的人，五年博士都读完了，所以大家一般不会选择做猴子，因为你等不及拿到F1代。我们就用精巢移植的办法把时间缩短到只有30个月，我们还用这个技术在2014年提早拿到了MeCP2转基因猴的F1代，而且证明这个猴子也继承了转基因。这样Nature杂志又重新考虑了我们这个工作，并最终接受和发表了该工作。从猴子怀孕到杂志接受整整历时五年，关键是我们解决了技术问题，让大家不那么恐惧五年时间的问题。这个工作也获得了2016年的十大科学进展。
我们还做了基因编辑猴，我们后续会有相关文章出来，出文章是我们平台给大家服务的关键。从技术角度看，我发现基因编辑技术看上去很好，但其实并不完美。举一个例子，我跟熊志奇老师合作的基因编辑猴，我们做了两轮，最后得到两只Prrt2基因嵌合体的猴子。它们的突变类型和比例都不同，其中有一只出现了类似基因突变病患的表型。但问题也在这里，因为得到两只猴，只有一只猴有（表型），也就是基因编辑技术由于嵌合突变导致我们很难在首代猴就得到基因型和表型一致的模型。所以虽然我们现在有两种模型猴构建技术，慢病毒介导的转基因技术（产生多位点多拷贝整合，导致基因型不同）和基因编辑技术。但是实际上它们还是不完美。不完美的体现就是无法在首代动物中得到基因型一致的个体。同时，胚胎水平操作使得复杂遗传操作很难实现，及无法通过近亲繁殖得到遗传背景一致的近交系，还有性成熟时间决定了传代建群时间在5年以上。
有没有技术能解决这些问题？有，就是体细胞核移植技术。为什么体细胞核移植技术能解决这些问题，因为你是在体细胞上操作，然后把它变成一个猴子。首先，这样操作的时候细胞筛选中可以筛选一致的细胞作为供体，就不会有嵌合体的问题，所以基因型是一致的，而且可以做复杂的操作，可以在细胞上操作多个基因。其次，得到的猴子遗传背景是一致的，因为都来自体细胞。猴子一个怀孕期160多天，这个技术一年可以得到一群猴子，并且遗传背景一致，所以非常完美。但首先你必须要做出克隆猴，这也是我们要攻关的事情。
攻关怎么做的？考虑到猴子是单胎生殖，卵母细胞资源有限，我们要一步一个脚印的走下去，不能用毕其功于一役的方法，我们采取了步步为营各个击破的办法。我们可以用基因编辑猴产生的废卵做移植，练技术，做各种尝试来节约资源和提升克隆胚胎的发育效率，用了5年实现终于实现了我们的目标，攻克了这一难题。今年1月25日对我们的新闻报告会之前和结束以后我都很平静。但是我没想到后面有铺天盖地的媒体报道，因为之前我们失败太多次了。失败怎么办？基地还是很闭塞的，一直得不到好的结果，情绪的感染很难避免。当时为了不影响团队，知道这个工作的重要性就三个人。最大的一次打击就是2017年8月份，我们生出两只猴子，分别活了3个小时和几十个小时就死了。那天我们的情绪非常低落，当你经历了漫长的等待，终于看到希望时，突然希望又破灭了，那种感觉就是在我们已经要达到终点的时候，终点突然消失了一样，且还有很长的路要走。
那怎么办呢？我们到太湖转了一下，太湖很敞亮，我们心情就放松了。我说其实我们是成功的，我们做的猴子已经成型了，我们继续再做。8月份，蒲老师知道结果后很高兴。那时候我很紧张，后来我调节过来，就做好最坏的打算，继续努力做，最后把它做出来。8月份的克隆猴我们是用成年体细胞做出来的。成年体细胞供体来自取卵时得到的颗粒细胞，颗粒细胞是跟卵子一起取出的，二者是同步的，这样我们就不会占用人力资源做细胞培养工作，所以最初条件摸索的时候我们就用用成年体细胞做。没做出来的确很可惜，说明我们还有好多路要走。到上个月底，胎猴来源的供体细胞克隆猴“中中”和“华华”已经出生半个年了，我们已经开始用大笼把它跟野生猴一养。
虽然我们成功得到了体细胞克隆猴，但我觉得这只是一个全新的起点，后面要做的事情还有很多。比如，在克隆猴技术本身的效率问题上，我们还有好多问题没有解决及如何利用这个技术实现模型猴的构建等。我相信接下来会有更多的人跟我们站在这个起点上，继续前进。这样让我感觉新的一年我们的紧迫感比前面更大了。这里要感谢蒲先生、神经所，神经所的合作伙伴对我们的不离不弃，对我们的支持。也感谢一下我的家人，因为这么多年，跟猴子待了这么长时间。
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